A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋摘要
剧中：目前自始蹂躏全球的最初型冠状微生物眼疾 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国际组织和周边地区大风靡，截至 2021 年 4 翌年已致使最多 1.28 亿人细菌感染，最多 280 所到之两处遇害。理论上，尚无可合理减少 COVID-19 伤人率的眼疾患工具。我们深入研究了一种有别于的里面药口服制剂——惟有肺毒口服液 (RDS) 的潜在外用冠状微生物活着特质，该口服液主要化学物质为东方临床有别于里面用做眼疾患肺泡结核眼疾的里面泡茶。
结果：RDS 诱发 SARS-CoV 较慢微生物、SARS-CoV-2 较慢微生物、混搭乙型微生物-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型微生物以及传染特质 SARS-CoV-2 和派生的 Ha-CoV-2 变种微生物 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对生物膜则会的细菌感染。我们全面证明了了 RDS 可以同样灭活着 SARS-CoV-2 微生物基质的传染特质。此外，我们挖掘成 RDS 还可阻碍乙型风靡特质感冒微生物对生物膜则会的细菌感染。
事实：RDS 可普遍诱发消化道微生物细菌感染。关键字：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状微生物，外用微生物眼疾患，惟有肺毒口服液，有别于里面药，SARS-CoV，乙型风靡特质感冒，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型微生物
▋剧中
目前自始蹂躏全球的最初型冠状微生物眼疾 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国际组织和周边地区大风靡，截至 2021 年 4 翌年已致使最多 1.28 亿人细菌感染，最多 280 所到之两处遇害。理论上，尚无可合理减少 COVID-19 伤人率的眼疾患工具。最初成现的 COVID-19 微生物微生物为冠状微生物 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在严重急特质呼种则会综合征相关冠状微生物种类里面的表兄弟微生物[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 起初都是在里面国挖掘成的；SARS-CoV 微生物于 2002 年 11 翌年在广东省首次被挖掘成[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 翌年在武汉首次被挖掘成[1,7,8]。在里面国，这两次由冠状微生物致使的疫情里面，里面药原则上被普遍用到，用以紧急应对冠状微生物致使的结核眼疾。对于理论上的 COVID-19 大风靡，里面国有最多 85% 的 SARS-CoV-2 细菌感染患者给与了有别于里面医药医学上（9，10）。许多用到的里面药确实具备合理的外用冠状微生物特特质并在诊疗上确实合理，这个重要问题尚未能给予确实答复。
里面药作为眼疾患冠状微生物所引发结核眼疾的合理医学上，但由于缺乏人体内或人体内的该系统深入研究，其发展与合理用到原则上受到了阻碍。为了受制于里面药的潜在外用 SARS-CoV-2 活着特质，我们从常用里面药里面检验了多种泡茶苯甲酸，并从里面药口服液 RDS(大英帝国一种商业特质酒类补充剂) 里面挖掘成了外用 SARS-CoV 和外用 SARS-CoV-2 微生物的活着特质，一种在大英帝国的商业酒类补充剂。RDS 用做减弱人体消化该系统的各个方面肥胖，其包内含多种泡茶化学物质，如大豆和酢浆草，它们是有别于上用做遏制续生和肺泡结核眼疾的里面泡茶 (11-13)。在此，我们另据 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假微生物以及具备细菌感染特质的野生型 SARS-CoV-2 微生物对生物膜则会的细菌感染具备贫乏特质。我们全面证明了 RDS 可通过同样灭活着微生物基质或迫使微生物大举进攻而诱发微生物的20世纪细菌感染进度。此外，我们挖掘成 RDS 还可以迫使乙流微生物对生物膜则会的细菌感染。这些说明了，RDS 对消化道微生物的细菌感染不太可能具备普遍的贫乏特质。
▋结果
为了从有别于里面泡茶里面找到潜在的外用 SARS-CoV-2 活着特质，我们从约四十种有别于泡茶里面检验所含成 SARS-CoV-2S 细胞假型较慢微生物[14,15] 和人体肺泡 A549(ACE2) 生物膜则会，此人类所 ACE2 基因则会通过较慢微生物转导作为核酯内皮细胞，从而稳定转导来借助超隐含。较慢假型微生物用到绿色荧光细胞 (GFP) 或荧光以次酶 (Luc) 作为另据基因，并通过了具备广谱外用微生物带入诱发剂，以及科莫阿克 (Arbidol)[16]，和人类所外用毒血清对外用 SARS-CoV-2(所示 1a、C) 的实验者。我们并能成功混合物到科莫阿克 (Arbidol) 和外用毒血清对于 SARS-CoV-2 假型微生物的贫乏特质，这是我们在其他四十余种有别于泡茶苯甲酸测试者里面没挖掘成的，除此以外其里面一些长期存在很低毒特质的泡茶 (所示 1a-C)。然而，鉴于较慢特质假型微生物大部分能混合物 SARS-CoV-2 微生物的大举进攻使用暴力，我们没法无关这些泡茶苯甲酸不太可能有在带入后收尾并能诱发 SARS-CoV-2 的不太可能特质。我们全面从有别于外用生以次惟有肺毒口服液 (RDS) 里面检验成了不太可能的外用 SARS-CoV-2 活着特质，该的产品内成分九种泡茶化学物质——、茴香、大豆、酢浆草、玄参、苦杏仁、蜂房、皂角、醋，在里面国有别于上用做眼疾患肺泡结核眼疾 (11-13)。
内成分乙基牛奶酯、3，4-二邻牛奶甲酰吗啡酯、乙基 3，4-二邻牛奶甲酰吗啡酯、原儿茶酯、乙基绿原酯和木犀草以次；花蕾里面还内成分生物碱 A、B 和 10 种大部分有环酮醚醇类生物碱[17]；该真菌还内成分皂甙甙 A 和 B，以及外用续生作用的生物碱 C[18,19]。茴香酯生物碱里面内成分木脂以次、松脂酮和茴香生物碱[20]。大豆里面内成分被称为大豆皂生物碱的甾体皂生物碱，是大豆属真菌独有的真菌化学物质[21,22]。细叶酢浆草里面主要活着特质化学物质为四种单醇类，(−)-香辛料酮、(+)-普博利厄酮、(−)-柠檬酮和 (+)-香辛料呋喃；这种真菌还内成分其他化合物，如 1-辛酮-3-酮、3-辛酮、β-翌年桂酮和β-石竹酮[23]。玄参内成分最多 162 种化合物，除此以外环酮醚醇类和环酮醚醇类生物碱、苯丙生物碱、有机酯、龙涎香、糖类、黄酮类、和皂生物碱[24]。苦杏仁里面内成分派生物、苯基化合物和麦芽多糖[25]。皂角刺里面内成分皂生物碱和羽扇豆酯[26,27]，而醋里面内成分主要活着特质化学物质醋酯[28]。为了全面测试者 RDS 的外用 SARS-CoV-2 活着特质，用多种不同一化学合成溶解度的 RDS 示例 A549(ACE2) 细胞则会，然后让这些细胞则会在长期存在 RDS 的情形下给与 4-6 两星期的细菌感染。细菌感染后，在不长期存在 RDS 的情形下指导细胞则会，然后在 48 和 72 两星期的时候，通过流式细胞则会法术对微生物细菌感染的贫乏特质完成化学合成。为了遏制细胞则会毒特质，用到碲丙啶 (PI) 对即将遇害和已遇害的细胞则会完成染色剂，大部分在活着细胞则会群里面统计分析 GFP+细胞则会。如所示 2 示意所示，我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假微生物具备溶解度贫乏特质贫乏特质。为了属实这些结果，我们用到内源特质隐含 ACE2 的 VeroE6 细胞则会单调了该细菌感染实验者。
(见下页所示)
ACE2 在表面上隐含，生产特质 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 微生物可对其完成细菌感染，ACE2 通常用做冠状微生物的深入研究 (7)。受制于在缺乏 ACE2 超隐含 [15，29，30] 的情形下，假型微生物对 VeroE6 的细菌感染特质较低，我们还用到了荧光以次酶另据基因假型微生物，该微生物的另据基因隐含由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，具备更高的另据基因敏感特质和信噪比。
所示 2：RDS 诱发 SARS-CoV-2(GFP) 假型微生物细菌感染 A549(ACE2) 细胞则会。
A.A549(ACE2) 细胞则会用 RDS 紧接著一化学合成 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型微生物细菌感染。将细胞则会洗去微生物和 RDS，并在不长期存在 RDS 的情形下完成指导。流式细胞则会祯混合物微生物细菌感染诱发情形。未能细菌感染的细胞则会和细菌感染 SARS-CoV-2(GFP) 但未能经 RDS 眼疾患的细胞则会作为依此。GFP+细胞则会平均值已结果显示。(PI) 碲丙啶。
B.RDS 的细胞则会毒特质化学合成。A549(ACE2) 细胞则会用 RDS 紧接著一化学合成 4 两星期，洗去 RDS，无 RDS 指导 48 两星期。碲丙啶染色剂认定自始在遇害细胞则会和已遇害细胞则会，流式细胞则会法术统计分析。绘出溶解度-反应会细胞则会毒特质曲面，RDS 的半伤人溶解度 (LC50) 比重为 1:11.9。
如所示 3A 示意所示，我们用到 Luc 报告基因假微生物和 VeroE6 细胞则会完成细菌感染实验者，捕捉到到 RDS 对该微生物细菌感染具备溶解度贫乏特质贫乏特质，并且分之一诱发溶解度受制于为 1:230RDS 一化学合成度 (所示 3B)。我们还化学合成了 RDS 对 VeroE6 细胞则会活着力的影响，受制于了 50% 细胞则会遇害溶解度为 1:11.8RDS 一化学合成度。
所示 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假微生物和野生型 SARS-CoV-2 微生物的溶解度贫乏特质诱发贫乏特质。用 RDS 紧接著一化学合成示例 A、BVeroE6 细胞则会，并用 SARS-CoV-2(Luc) 假型微生物细菌感染。将细胞则会洗去微生物和 RDS，并在不长期存在 RDS 的情形下完成指导。在细菌感染后 72 两星期用荧光以次酶混合物微生物细菌感染的贫乏特质。未能细菌感染细胞则会和 SARS-CoV-2-luc 细菌感染但未能经过 RDS 眼疾患的细胞则会作为依此。实验者单调三次。绘出溶解度反应会曲面和 RDS 的 I-C50 一化学合成比重为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞则会的细胞则会毒特质也通过碲丙啶染色剂和流式细胞则会法术化学合成。用 RDS 紧接著一化学合成 4 两星期，洗去 RDS，在不内含 RDS 的情形下指导 72 两星期。绘出细胞则会毒特质溶解度-反应会曲面，RDS 的半伤人溶解度 (LC50) 比重为 1:13.8 一化学合成。DRDS 诱发传染特质 SARS-CoV-2 细菌感染。用紧接著一化学合成的 RDS 示例 VeroE6 细胞则会，并在 RDS 长期存在的情形下细菌感染 SARS-CoV-2。细菌感染 48 两星期后，通过炎菌斑统计分析微生物无罪释放后的微生物激活着诱发情形。诱发试验一式共五完成，并在 Prism7(Graph Pad) 里面用到单向均参数 (One-Way ANOVA) 统计分析及 Dunnett 后检验 (Dunnett's Post Test)，借此受制于统计数字显着特质。显著特质参数用星号坚称如下：*p
为了全面实验者用到假微生物获的结果，我们测试者了 RDS 对于 SARS-CoV-2 细菌感染的阻碍传染特质意志力。如所示 3D 示意所示，RDS 同时也阻碍了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞则会的细菌感染。RDS 在一化学合成 1:40 以上时可显著减少微生物斑块的演化成。
综上，通过 SARS-CoV-2 假微生物与传染特质微生物的说明了，RDS 内成分诱发 SARS-CoV-2 细菌感染的活着特质化学物质，不太可能是通过同样灭活着微生物或阻碍微生物的20世纪细菌感染进度。
为全面深入研究不太可能的机制，我们将传染特质 SARS-CoV-2 微生物基质与紧接著一化学合成的 RDS 在 37°C 下预指导 1 两星期。随后，将混搭物全面依次一化学合成-(10–1 至 10–4)，并转为 Vero 细胞则会完成炎菌斑统计分析以受制于微生物细菌感染特质的减少。如所示 4A 示意所示，我们捕捉到到在 RDS 里面短暂暴露一两星期后的微生物基质，其 SARS-CoV-2 的细菌感染效价也长方形溶解度贫乏特质回升。该结果属实了 RDS 可合理同样灭活着 SARS-CoV-2 微生物基质的传染特质。
我们全面测试者了 RDS 确实也能诱发 SARS-CoV-2 微生物变种的细菌感染。为此，我们为了让最近开发设计的混搭乙微生物-SARS-CoV-2 假型微生物 (Ha-CoV-2)[31] 来氢化一两部 S 细胞举例来说，除此以外大英帝国举例来说 (B.1.1.7)，尼日利亚举例来说 (B.1.351)，巴西举例来说 (P.1)，加州举例来说 (B.1.429)，和其他几个最初兴举例来说 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和相关 S 细胞突变体在 37°C 紧接著一化学合成 RDS 指导 1 两星期。随后，用该混搭物细菌感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 生物膜则会。细菌感染后 12 两星期，荧光以次酶精确测量微生物细菌感染的贫乏特质。如所示 4B 示意所示，我们还捕捉到到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 细胞举例来说的溶解度贫乏特质诱发。
我们还测试者了 RDS 阻碍 SARS-CoV 细菌感染的意志力，用到十分相似 SARS-CoV 突刺细胞的 GFP 另据基因较慢微生物和[15] 伪溶解度。我们将人 A549(ACE2) 细胞则会用作生物膜则会，将其用两部一化学合成的 RDS 示例，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因假微生物细菌感染 4-6 两星期。细菌感染后在不内含 RDS 的情形下指导细胞则会，流式细胞则会法术化学合成混合物其对微生物细菌感染的贫乏特质。同样，用到碲丙啶无关自始在遇害与已遇害的细胞则会，大部分在活着细胞则会群里面统计分析 GFP+细胞则会。如所示 5A 示意所示，我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型微生物的贫乏特质长方形溶解度贫乏特质。我们全面属实了这些结果，并化学合成了 RDS 内皮细胞的诱发与 Luc 另据基因 SARS-CoV 假型微生物，SARSCoV(Luc)。我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的贫乏特质长方形溶解度特质贫乏，其半诱发溶解度 (IC50) 为 1:70.88 一化学合成度 (所示 5B，C)。受制于 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都用到 ACE2 细菌感染生物膜则会，我们还测试者了 RDS 的外用微生物活着特质确实大部分针对与 ACE2 有相互作用的冠状微生物。为此，我们混合物了一种比如说负链 RNA 微生物--乙型风靡特质感冒微生物。它通过微生物血凝以次 (HA) 和细胞则会α-唾液酯来细菌感染生物膜则会。为了氢化乙型风靡特质感冒微生物，将隐含乙型风靡特质感冒 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个录像的 8 个核酯和一个 GFP-另据基因共计转染到 HEK293T 细胞则会里面。在 RDS 长期存在的情形下，收集微生物基质并用做细菌感染目标 MDCK 细胞则会。如所示 6A 示意所示，我们捕捉到到 RDS 对乙型风靡特质感冒微生物的贫乏特质长方形溶解度贫乏特质。RDS 在 1:40 和 1:80 一化学合成时可实际上阻碍微生物细菌感染，在 1:160 一化学合成时则可部分诱发乙型风靡特质感冒。RDS 对 MDCK 细胞则会的半伤人溶解度 (LC50) 经精确测量为 1:18.5(所示 6B)。这些说明了，RDS 的外用微生物活着特质并非针对特定微生物，而不太可能并能普遍诱发多种消化道微生物，如冠状微生物和乙型风靡特质感冒微生物。
▋研讨
在本报告里面，我们证明了了有别于外用生以次惟有肺毒口服液 (RDS) 内成分广谱外用微生物活着特质，可阻碍 SARS-CoV、SARSCoV-2 和乙型风靡特质感冒微生物的细菌感染。虽然 RDS 并能诱发多种微生物，但其外用微生物活着特质因微生物子类和毒株而异。例如，对 SARS-CoV 较慢假微生物的 I-C50 溶解度为 1:7.9 一化学合成度，对 SARS-CoV-2 较慢假微生物的 I-C50 溶解度为 1:230 一化学合成度。对于传染特质野生型 SARS-CoV-2 微生物，I-C50 为 1:40 一化学合成度，对乙型风靡特质感冒，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其变种有多种不同的贫乏特质，IC50 数参数从 1:70 到 1:2601 一化学合成度不等 (所示 4B)。
(见下一页所示)
所示 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和派生的 Ha-CoV-2 变种具备溶解度贫乏特质灭活着作用。ASARS-CoV-2 基质加紧接著一化学合成的 RDS 在 37°C 下指导 1 两星期。随后，将混搭物全面紧接著一化学合成，并转为 Vero 细胞则会里面完成炎菌斑统计分析，以受制于微生物细菌感染特质减少。诱发试验一式共五完成，并在 Prism7(GraphPad) 里面用到单向均参数 (One-WayANOVA) 统计分析和 Dunnett 后检验 (Dunnett'sPostTest) 借此受制于统计数字显着特质。显著特质参数用星号坚称如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和相关 S 细胞举例来说与紧接著一化学合成的 RDS 在 37°C 指导 1 两星期后，用混搭物细菌感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 生物膜则会。细菌感染后 12 两星期，荧光以次酶精确测量微生物细菌感染的贫乏特质。RDS 的 IC50 参数的一化学合成度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们全面证明了了 RDS 可以诱发冠状微生物的20世纪细菌感染进度。虽然确切的外用微生物机制尚未能确切，但 RDS 可以通过同样灭活着微生物基质或通过迫使微生物大举进攻或阻碍微生物大举进攻后的20世纪进度来迫使微生物细菌感染。在其他几种有别于里面药里面也挖掘成了外用 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活着特质。例如，一种类似的有别于里面药——醋。
醋根里面已证明了内成分醋酯以次，可诱发 SARS 微生物[32] 诊疗分开株的激活着。此外，另一种可用做眼疾患消化道结核眼疾的里面药——双黄连制剂，已结果显示成在人体内以溶解度贫乏特质方式诱发 SARS-CoV-23CL 细胞酶 (3CLpro) 活着特质。石杉生物碱和石杉以次拟作为双黄连阻碍 3CLpro[33] 的合理化学物质。
所示 5 RDS 诱发 SARS-CoV 假型微生物对 A549(ACE2) 细胞则会的细菌感染。用紧接著一化学合成的 RDS 示例 A、B 细胞则会，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型微生物细菌感染。将细胞则会去除，去除微生物和 RDS，在不长期存在 RDS 的情形下完成指导。在细菌感染后 48 两星期和 72 两星期，通过流式细胞则会法术或荧光以次酶混合物来化学合成微生物细菌感染的贫乏特质。实验者单调三次。绘出溶解度响应曲面，并绘出 RDS 的 IC50 参数为 1:70.9 一化学合成度 (C)
所示 6 RDS 诱发乙流微生物对 MDCK 细胞则会的细菌感染。(A) 用紧接著一化学合成的 RDS 示例 MDCK 细胞则会 30 分钟，然后用乙流微生物 (GFP) 对其完成细菌感染。细菌感染后，在 RDS 长期存在下指导细胞则会。36 两星期后用流式细胞则会祯对微生物细菌感染的贫乏特质完成化学合成。把未能细菌感染的细胞则会与被乙流微生物 (GFP) 细菌感染但未能经 RDS 两处理事件的细胞则会完成对比。所示里面结果显示了 GFP+细胞则会的平均值。PI 坚称碲丙啶 PI。
(B) 另外还用到了 MTT 精确测量法化学合成了 RDS 对 MDCK 细胞则会的毒特质，绘出了细胞则会毒特质的溶解度-反应会曲面，经数参数，RDS 的分之一伤人溶解度为 1:18.5 一化学合成度 RDS 的合理外用微生物化学物质尚未能受制于。然而，RDS 多种不同于石杉生物碱和石杉以次，RDS 可以通过同样灭活着微生物光子来阻碍微生物细菌感染 (所示 4)，而石杉生物碱和石杉以次则在微生物生命周期的中期通过阻碍微生物细胞酶的活着特质来无论如何。然而，RDS 的人体内外用 SARS-CoV-2 活着特质仍需在更全面的动物深入研究和人类所诊疗试验里面给予属实。目前，我们自始在完成小型动物实验者，以受制于 RDS 在人体内阻碍 SARS-CoV-2 微生物细菌感染的潜力。
▋事实
我们的深入研究说明了，RDS 可普遍诱发消化道微生物的细菌感染，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和乙型风靡特质感冒。
▋工具
细胞则会和细胞则会指导
HEK293T (ATCC 巴里迪亚，最初泽西州) MDCK (ATCC 巴里迪亚，最初泽西州)，VeroE6 (ATCC 巴里迪亚，最初泽西州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 送给，巴里迪亚，最初泽西州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 送给，巴里迪亚，最初泽西州) 目前完好于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔信息技术 Thermo Fisher Scientific) 内成分 10% 热灭活着 FBS 和 1×青霉以次-链霉以次 (赛默飞世尔信息技术 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞则会指导基里面分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的溶解度转为嘌呤霉以次和潮霉以次 B。
线粒体转染和微生物氢化
内含 SARS-CoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的较慢特质假型微生物基质由 Virongy LLC (Manassas，VA) 共计享，或按照在后描述的工具[15] 氢化。简言之，为了氢化 GFP 另据基因较慢特质假微生物，HEK293T 细胞则会与隐含 SARS-CoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的核酯、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共计转染。为了产成荧光以次酶另据基因较慢特质假型微生物，将 HEK293T 细胞则会与隐含 SARSCoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的核酯、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 完成共计转染。转染后 48 两星期收集微生物上清液，离心稀释，−80℃ 完好。野生型 SARS-CoV-2 微生物 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 共计享。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因线粒体和 A/WSN/1933 H1N1 派生线粒体 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 指导教授友好共计享。在风靡特质感冒微生物 A-GFP 另据基因光子氢化里面，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共计转染 HEK293T 细胞则会 (ΔAT6)。48 两星期后收集微生物上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 隐含核酯购自 Sinobiological。为了让 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 核酯和 S 细胞突变核酯。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 细胞突变光子按照在后描述工具[31] 完成氢化。
微生物细菌感染和外用生以次诱发试验
RDS(惟有肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 送给，利斯堡，最初泽西州) 是由马指导教授实验者室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种商业的产品。RDS 里面所有里面泡茶化学物质原则上符合《里面国修订本 2015 年版》「饮片」常规，除此以外合理化学物质内含铁及金属乐、农药纪念版混合物。RDS 是一种里面药的共计煎剂，就此副的产品在真空前提下蒸发。SARS-CoV-2 外用血清由 LanceA. Liotta 医生共计享。将科莫朵尔盐酯盐 (Sigma) 重最初悬浮在二乙基亚砜 (Sigma) 里面。对于假型微生物细菌感染，12 孔板里面的 A549(ACE2) 细胞则会 (来自 Virongy LLC 送给，巴里迪亚，最初泽西州) 或 VeroE6 细胞则会用 RDS 示例 30 分钟，在 37℃ 下细菌感染 4-6 两星期，然后在最初鲜指导基里面净水指导 48-72 两星期。对于 VeroE6 细胞则会的细菌感染，细胞则会也被 CoV-2 假型微生物细菌感染减弱剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 送给，巴里迪亚，最初泽西州) 示例后，在 37°C 下如此一来两处理事件 30 分钟。用到 GloMaxDiscover 酶标祯 (Promega) 统计分析细胞则会裂解物的荧光以次酶活着特质。对于野生型 SARS-CoV-2 细菌感染，VeroE6 细胞则会在 37°C 下用 RDS 示例 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 细菌感染 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在詹姆斯梅森该大学的 BSL-3 收容配套内停留 1 两星期。细胞则会用 PBS 净水 2 次，用内含 RDS 的指导基指导 48 两星期。从上清里面所含微生物，用 12 孔板指导的 Vero 细胞则会单层里面的炎菌斑试验精确测量小瓶滴度。简言之，每个混合物在明晰的 Dul-becco's ModifiedEagle 指导基 (VWR) 里面氢化，包内含 1X 青霉以次-链霉以次 (VWR)，并移除 10% 的 FBS(赛默飞世尔信息技术 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种一化学合成液种则会附到 VeroE6 细胞则会单层的三个平行孔上 1 两星期。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一部分明晰的 Eagle Minimal Essential 指导基 (VWR) 的混搭物覆盖单层，内含 1X 青霉以次-链霉以次，并移除 10%FBS。48 两星期后，将单层腹腔固定在 10% 乙醛溶液里面 1 两星期，并去除覆盖的琼脂塞。为了染色剂斑块，转为内成分 20% 乙酮的 1% 粉末紫染料溶液 5 分钟，然后用去离子水净水。对于乙型风靡特质感冒微生物细菌感染 MDCK 细胞则会，在 37°C 下用 RDS 示例 30 分钟，然后用 A-GFP 另据基因微生物细菌感染 6 两星期。用内含 RDS 的指导基净水细胞则会，指导 36 两星期。GFP 隐含通过流式细胞则会祯化学合成。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 微生物基质的 RDS 灭活着试验，将 100μl 紧接著一化学合成的 RDS 移除到 1 mlSARS-CoV-2 微生物原液 (3.65×105PFU/ml) 里面，就此 RDS 一化学合成为 1:20，1:40 或 1:80。也除此以外依此前提 (1 ml 微生物+100μl 指导基)。混搭物在 37°C 下指导 1 两星期。随后，对混搭物完成两部一化学合成以产生额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 一化学合成度，并将紧接著一化学合成的混合物转为 12 孔板里面的 Vero 细胞则会里面，用做完成炎菌斑精确测量统计分析。斑块精确测量里面就此的 RDS 一化学合成度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 一化学合成液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 细胞突变光子按照在后描述的工具[31] 氢化。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活着，将 5μl 紧接著一化学合成的 RDS 移除到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或举例来说里面，就此 RDS 一化学合成度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将混搭物在 37°C 下指导 1 两星期，然后在 RDS 长期存在下细菌感染 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞则会 12 两星期。用到 GloMax Discover 酶标祯 (Promega) 统计分析细胞则会裂解物的荧光以次酶活着特质。
细胞则会毒特质统计分析混合物
用碲丙啶染色剂和流式细胞则会法术化学合成对 A549 (ACE2) 细胞则会和 VeroE6 细胞则会的外用生以次细胞则会毒特质完成混合物，如所述 (34)。用到细胞则会续殖试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商敦促的方案对 MDCK 细胞则会的外用生以次毒特质完成化学合成。简言之，将 MDCK 细胞则会 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞则会的速率哺育到 12 孔板里面。细胞则会指导隔夜后，通过 RDS 两处理事件 1 天，然后在 MTT 标记试剂 (Sigma) 的指导基里面指导。将细胞则会与标记试剂共计同指导 4 两星期，如此一来后续转为 MTT 续溶液。指导皿孵化过夜，用 GloMax Discover 酶标祯 (Promega) 精确测量种则会表面温度。
全称
SARS-CoV：严重急特质消化该系统综合症相关冠状微生物；SARSCoV-2：Severe 严重急特质消化该系统综合症相关冠状微生物-2；TCM：有别于里面药；RDS：消化道摄入口服液；Ha-CoV-2：混搭乙型最初冠微生物假微生物。
致谢
答谢 FengLi 共计享风靡特质感冒微生物隐含核酯，答谢 LanceLiotta 共计享外用毒血清；答谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的研讨与敦促；答谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 共计享 RDS 和泡茶苯甲酸。
所写建树
此次实验者由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 建筑设计，由 Y.W. 刊载，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该实验者。所有所写已读者并审批就此代笔。
资金
本深入研究的补助来自于詹姆斯梅森该大学在表面上拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 共计享。
数据和材质的可用特质
本深入研究里面产生或统计分析的所有数据原则上包内含在本文里面。试剂可从 Y.W 两处给予。
声明
审批及参与达成协议
不大部分限于
达成协议撰写
不大部分限于
竞争权益
詹姆斯梅森该大学国际组织生物牵制和传染眼疾里面心的 RMH 和 YW 已获了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的深入研究资助，LAH 为德佳和畅转任任职期间并获了酬劳。没其他关系或活着动不太可能则会影响到提交的文书工作。
所写详细信息
1大英帝国最初泽西州詹姆斯梅森该大学认知社会科学学院国际组织生物牵制和传染眼疾里面心，巴里迪亚 20110。
2VirongyLLC，最初泽西州巴里迪亚。3加拿大伯纳比，BCV5J0E5 马指导教授实验者室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 大英帝国最初泽西州利斯堡世界卫生社会科学其组织，20176。
收稿日前：2021 年 4 翌年 7 日
给与日前：2021 年 5 翌年 10 日
线上撰写时间：2021 年 5 翌年 29 日
引文
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编辑： 翟超男相关新闻
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